|
|
117574, Москва, проезд Одоевского, дом 3 корп. 7, тел. (499) 400-27-54
Влияние многократных инъекций препарата натриевой соли никотиноил гамма-аминомасляной кислоты на состояние ГАМК-шунта и некоторые сопряженные метаболические пути в головном мозге
УДК 615.214,31.03:616.831-08
В.А.Розанов
Одесский медицинский институт им. Н.И.Пирогова, кафедра биохимии
Одной из актуальных задач доклинического испытания новых фармакологических веществ является изучение их метаболических эффектор in vivo. Применительно к ГАМК-эргическим препаратам такой подход предусматривает наряду с другими направлениями исследований анализ их влияния на процессы метаболизма ГАМК в ЦНС. Согласно современным представлениям, система ГАМК участвует в ограничении стресс-реакции и тем самым предупреждает развитие необратимых повреждений при стрессе /1/. Вместе с тем неоднократно указывалось на возможность осуществления реакциями ГАМК-шунта вспомогательной метаболической функции, заключающейся в обходе
á-кетоглутаратдегидрогеназной стадии цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) и образовании дополнительных количеств энергично окисляющегося сукцината /2, 3/. В последнее время системе метаболизма ГАМК придается значение как существенному звену так называемого быстрого трансаминазного пути окисления, или цикла Браунштейна /4/. В связи с этим целенаправленное изучение в ЦНС модифицирующего влияния новых ГАМК-конъюгатов на интенсивность функционирования ГАМК-шунта рассматривается нами как существенный момент обоснования их противогипоксического и ноотропного действия.
Методика
Исследования проводили на белых крысах-самках Вистар массой 180 - 220 г. Животным вводили пикамилон (внутрибрюшинно, на физиологическом растворе, в виде серии из 5 инъекций в течение 2 сут, разовая доза 10 мг х кг -1 массы, суммарная - 50 мг х кг -1. Для суждения о возможности распада препарата на составляющие его компоненты метаболические эффекты пикамилона сравнивали с влиянием ГАМК и никотината вводимых в эквимолярных дозах по стандартной схеме. Животных забивали через 1 ч после последней инъекции исследуемых соединений. Головной мозг быстро извлекали и разделяли на мозжечок, кору и стволовую часть. Образцы нервной ткани гомогенизировали и определяли содержание глутамата (ГЛ) и ГАМК методом хроматографии на бумаге, активность ферментов ГАМК-шунта - глутаматдекарбоксилазы (ГДК) и ГАМК-á- кетоглутаратаминотрансферазы (ГАМК-Т) методами И.А. Сытинского и М.Ш. Промыслова в нашей модификации /5/. При определении ГДК-активности оценивали максимальную и исходную (эндогенную) ГДК-активность, которая в определенной степени отражает количество и активность апо-ГДК в нервной ткани /6/. Одновременно определяли интенсивность окисления á -кетоглутарата (КГДК-активность) при помощи феррицианидного метода /7/ и аминотрансферазную активность (ACT и АЛТ), отражающую интенсивность восполняющих процессов, сопряженных с ЦТК, по Л.М. Осадчей /8/.
Результаты и их обсуждения
Как выяснилось, курс инъекций пикамилона приводит к ряду существенных и статистически значимых изменений активности ферментов, которые отличались выраженной неоднородностью в различных отделах мозга (табл. 1). Как следует из табл.1, КГДК - активность, отражающая суммарный процесс окисления á -кетоглутарата, не изменяется в мозжечке и стволовой части мозга и достоверно снижается в коре. ГАМК-Т-активность, отражающая интенсивность альтернативного, ГАМК-трансаминазного окисления á -КГ в мозжечке достоверно увеличивается (на 20%) и не изменяется в коре. Вследствие этого соотношение максимальных активностей КГДК/ГАМК-Т в мозжечке остается в пределах значений, наблюдаемых у контрольных животных (1,62 - 1,79), а в коре снижается до 2,45 при норме 2,78. Таким образом, в коре на фоне снижения интенсивности окисления á -КГ сохраняются возможности утилизации á -КГ-трансаминазным путем, в то время как в мозжечке в результате серии инъекций никотиноил-ГАМК увеличивается пропускная способность как основного (КГДК), так и альтернативного (ГАМК-Т) пути окисления á -КГ. Поскольку активность других аминотрансфераз, также играющих роль альтернативных путей использования á -КГ (ACT и АЛТ), после введения пикамилона не изменяется, точкой приложения действия пикамилона будет система метаболизма ГАМК.
Это подтверждается наблюдаемыми изменениями других ее компонентов, в частности ГДК-активности, которая достоверно снижается в мозжечке и повышается в стволовой части мозга. В полном соответствии с повышенной ГАМК-Т-активностью и сниженной ГДК-активностью в мозжечке отмечено достоверное снижение уровня ГАМК. Такое же уменьшение содержания ГАМК наблюдается и в стволовой части мозга, однако здесь оно выявляется на фоне повышения ГДК-активности и тенденции к повышению ГАМК-Т-активности. Существенных изменений уровня глутамата не обнаружено. Как следствие этого отношение ГЛ/ГАМК, отражающее отношение фонда возбуждающего и тормозного нейромедиатора в мозжечке и стволовой части, заметно возросло (5,22 и 3,80, в контроле и 2,47), а в коре незначительно снизилось (3,64, в контроле 4,16).
Таблица 1
Изменения в системе ГАМК и сопряженных процессах после серии инъекций никотиноил- ГАМК (10 мг · кг -1 массы, n=8-20, х, х min – x max)
Показатель |
Отдел мозга |
Условия опыта |
физиологический раствор (контроль) |
никотиноил–ГАМК (опыт) |
КГДК-активность, мкмоль á-КГ · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
0,674-(0,448-0,823)
0,816(0,609-1,056)
0,721(0,501-0,931) |
0,727(0,376-0,949)
0,678(0,412-0,859)*
0,689(0,430-0,913) |
ГДК-активность, мкмоль ГАМК · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
0,496(0,317-0,526)
0,238(0,159-0,341)
0,270(0,153-0,368) |
0,365(0,206-0,493)*
0,241(0,085-0,388)
0,356(0,202-0,465)* |
Исходная ГДК-активность, мкмоль ГАМК · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
0,035(0,014-0,075)
0,029(0,012-0,088)
0,048(0,012-0,078) |
0,058(0,024-0,100)*
0,041(0,029-0,052)
0,045(0,020-0,069) |
ГАМК-Т-активность, мкмоль гл · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
0,375(0,306-0,495)
0,286(0,232-0,423)
0,299(0,207-0,363) |
0,448(0,361-0,550)*
0,277(0,194-0,357)
0,350(0,273-0,425) |
аст-активность, мкмоль пирувата · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
6,00(3,34-9,85)
4,76(3,00-6,20)
5,36(3,10-6,90) |
5,92(3,45-8,64)
4,56(2,83-6,10)
5,51(3,34-7,40) |
алт-активность, мкмоль пирувата · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
1,20(0,85-1,99)
0,70(0,34-1,43)
0,70(0,45-0,90) |
1,43(0,95-2,47)
0,68(0,45-1,17)
1,00(0,59-1,67) |
Содержание гл,
мкмоль · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
9,24(6,25-13,44)
8,73(7,16-9,76)
7,13(5,05-9,48) |
9,66(7,18-14,53)
7,39(6,52-10,36)
7,82(5,51-11,53) |
Содержание гамк, мкмоль · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
2,63(1,05-5,15)
2,10(1,06-3,39)
2,89(2,03-3,73) |
1,85(0,52-3,54)*
2,03(0,91-3,63)
2,06(1,16-2,96)* |
*р < 0,05, двусторонний критерий Манна-Уитни; М – мозжечок; К - кора;
С - стволовая часть мозга.
Определенный интерес представляет сопоставление максимальной и исходной ГДК-активности. Как видно из данных табл.1, курс инъекций пикамилона вызывает снижение максимальной ГДК-активности в мозжечке и не изменяет ее в коре, в то время как эндогенная (исходная) ГДК-активность в этих отделах мозга заметно возрастает (в мзжечке -статически значимо). Таким образом, увеличение количества апофермента ГДК сочетается в данном случае со снижением субстрат- и кофакторактивируемой ГДК-активности, что свидетельствует об уменьшении активности фермента.
В целом можно сделать следующее заключение: введение никотиноил-ГАМК (пикамилона) в дозах, близких к клиническим, приводит к активации утилизации эндогенной ГАМК и торможению ее продукции, что сопровождается снижением ее содержания в нервной ткани. Эти изменения наиболее отчетливо проявляются в мозжечке и в этом отделе мозга остаются с интенсификацией окисления á-КГ. В коре изменения метаболизма ГАМК не выявляются и отмечается торможение окисления á-КГ. В стволовой части мозга эффекты пикамилона заключаются в активации ее продукции в ГДК-реакции и незначительном усилении ее утилизации, чему сопутствует тем не менее снижение ее содержания в нервной ткани.
Сопоставление наблюдаемых изменений с эффектами ГАМК и никотината-Na, вводимых в эквимолярных дозах и по стандартной схеме, показало, что вызванные пикамилоном изменения метаболизма отличаются своеобразием и не совпадают с эффектами ни ГАМК, ни никотината. Эффекты ГАМК подробно проанализированы нами ранее /6/, а никотината-На представлены в табл. 2. Из данных табл. 2 видно, что некоторые изменения активности ферментов, в частности снижение максимальной ГДК-активности и повышение ГАМК-Т-активности в мозжечке, совпадали с влиянием пикамилона. Однако при действии никотината исходная ГДК-активность не повышается, не наблюдается снижения уровня ГАМК, но отмечается достоверное уменьшение содержания ГЛ. Как следствие этого отношение ГЛ/ГАМК резко снижается в мозжечке (2,56 при контроле 3,51) или остается неизменным в коре и стволовой части мозга.
Полученные данные свидетельствуют, что пикамилон оказывает самостоятельное метаболическое действие, не обусловленное влиянием витаминного компонента (никотината) или высвобождающихся из его состава молекул ГАМК. Эти выводы совпадают с данными о биотрансформации меченого никотиноил-ГАМК, представленными в настоящем сборнике из которых следует, что никотиноил-ГАМК относится к устойчивым неметеболизируемым фармакоагентам и выделяется из организма в основном в неизмененном виде. В целом можно отметить, что защитное действие пикамилона при гипоксии и стрессе может быть связано не только с нормализацией тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования /9/, но и с интенсификацией (или поддержанием нормального Уровня функционирования) метаболического ГАМК-шунта.
Таблица 2
Изменения в системе ГАМК и сопряженных процессах после серии инъекций никотината- Na (5 мг · кг -1 массы, n=6-14, х, х min – x max)
Показатель |
Отдел мозга |
Условия опыта |
физиологический раствор (контроль) |
Никотинат (опыт) |
КГДК-активность, мкмоль á-КГ · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
0,674-(0,448-0,823)
0,816(0,609-1,056)
0,721(0,501-0,931) |
0,730(0,680-0,788)
0,695(0,609-0,752)
0,695(0,644-0,734) |
ГДК-активность, мкмоль ГАМК · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
0,496(0,317-0,526)
0,238(0,159-0,341)
0,270(0,153-0,368) |
0,238(0,104-0,283)*
0,166(0,107-0,234)*
0,268(0,090-0,255) |
Исходная ГДК-активность, мкмоль ГАМК · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
0,035(0,014-0,075)
0,029(0,012-0,088)
0,048(0,012-0,078) |
0,036(0,009-0,057)
0,020(0,010-0,030)
0,043(0,024-0,075) |
ГАМК-Т-активность, мкмоль гл · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
0,375(0,306-0,495)
0,286(0,232-0,423)
0,299(0,207-0,363) |
0,461(0,410-0,522)*
0,352(0,282-0,449)
0,391(0,370-0,488)* |
аст-активность, мкмоль пирувата · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
6,00(3,34-9,85)
4,76(3,00-6,20)
5,36(3,10-6,90) |
5,92(4,11-9,170)
5,10(3,70-7,34)
5,30(3,67-7,34) |
алт-активность, мкмоль пирувата · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
1,20(0,85-1,99)
0,70(0,34-1,43)
0,70(0,45-0,90) |
1,09(0,78-1,95)
0,68(0,34-0,94)
0,75(0,58-1,06) |
Содержание гл,
мкмоль · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
9,24(6,25-13,44)
8,73(7,16-9,76)
7,13(5,05-9,48) |
5,61(4,57-6,22)*
7,38(5,35-8,95)
5,61(3,48-7,04)* |
Содержание гамк, мкмоль · г -1
ткани · мин -1 |
М
К
С |
2,63(1,05-5,15)
2,10(1,06-3,39)
2,89(2,03-3,73) |
2,19(1,64-3,86)
1,66(0,63-3,87)
2,44(1,30-4,94) |
*р < 0,05; М – мозжечок; К - кора; С - стволовая часть мозга.
Список литературы
1. Меерсон Ф.3. Физиология адаптационных процессов.- М: Наука, 1986. - С. 521 – 631.
2. Сытинский И.А. Гамма-аминомасляная кислота в деятельности центральной нервной системе. - Л: Наука, 1972. -С. 200.
3. Сытинский И.А. Гамма-аминомасляная кислота - медиатор торможения. - Л.: Наука, 1977. – С. 139.
4. Кондрашова М.Н.// Тез. докл. 1 Всес. конф. по фарм. коррекции гипоксических состояний. Москва, 27 - 28 января 1988 г. - Ижевск, 1988. - С. 66 - 67.
5. Розанов В.А.// Вопр. мед. химии. – 1980. - Т. 26. -№1 - С. 42 - 46.
6. Розанов В.А., Карпович Г.А., Сергеева 0.Н. и др.// Вопр .мед. химии, - 1988. - Т. 34. -№1. - С. 29 - 33.
7. Gub1ег С . J.//J.Biol.Chem. - 1961. - Vol. 236. - p. 3112 - 3120.
8. Осадчая Л.М. Методы биохимических исследований. -Л: ЛГУ, 1982. - С. 246 - 250.
9. Кресюн В.0.// Бюл. экспер. биол. мед. - 1984. - № 4. С. 396 - 399.
|